DNA多久就验不出来了（揭秘DNA分解的因素与速度）

一、dna多久能出来

韩兴涛副

洛阳中心

二、dna要多长时间

一、dna多少天检测不出来

DNA疫苗始于20世纪90年代，当时，Wolff等人将外源基因的DNA质粒直接通过肌肉注射入小鼠体内，注射后60天，在小鼠体内检测到外源基因的局部表达蛋白。Wolff等人和其他研究小组发现，由于注射的质粒DNA大多以非复制、未整合的环状形式存在，这些注射入体内的外源基因质粒被整合入宿主基因组中的占比可以忽略不计，甚至远远低于自发性突变的概率，也就是说，DNA疫苗并不会引发危险的基因突变。此外，在临床前和临床试验中，与病毒载体疫苗相比，DNA疫苗也未发现会诱发自身抗体的异常强化，从而消除了导致自身免疫性疾病的风险。

DNA疫苗的给药途径包括肌内注射（IM）、皮内注射（ID）、经黏膜或皮下注射（SC）、口服、静脉注射等。与其他类型的疫苗相比，DNA疫苗的优势包括接种方式和接种途径的安全性的提高 、良好的可调控性、生产过程的简化、成本效益的提高等。而DNA疫苗在一般环境温度下的稳定性质，也优于mRNA疫苗所需的超低温储存和冷链运输,更加易于储存和运输。

与减毒活疫苗相比，DNA疫苗具有安全的临床特征，DNA疫苗中含有的简化DNA序列，使抗原毒力缺乏恢复到病毒毒力的能力，也不会影响到接种者的正常基因。此外，DNA疫苗能够以不同的DNA序列为基础，激活接种者的自然体液免疫和细胞免疫，灵活地刺激机体产生不同抗原。加上DNA疫苗可以快速生产并广泛分配到资源有限的地区，将DNA疫苗应用在流行病爆发中进行的大规模疫苗接种措施中尤为重要。

DNA疫苗的作用

DNA疫苗的作用机制是，机体接种含有编码抗原基因的真核表达质粒DNA后，被接种者的体细胞摄取，随后经过转录、翻译，表达出相应的抗原，诱导机体产生免疫应答，故而DNA疫苗中所含质粒的选取尤为重要。

早期DNA疫苗中使用的质粒来源于细菌，但细菌的质粒序列有可能无法在哺乳动物细胞中产生良好的基因表达，也存在一定的安全问题，例如，选取的质粒中如果含有细菌的抗生素抗性基因，该基因可能影响宿主体内正常微生物群或诱导炎症反应。现在所应用的DNA疫苗则减少了细菌序列的数量，以实现抗原表达增加的同时减轻安全问题。而对DNA疫苗的研究越深入，需要人们着手解决的问题则越多，除了要筛选低风险、高表达的质粒外，如何提升DNA疫苗的作用效果的问题，仍然横在人们面前。

DNA疫苗的实际作用，取决于其内抗原能否被接种者的细胞高效摄取。要引起免疫反应，DNA疫苗必须穿透细胞外膜和细胞核膜的障碍，才能得到复制和表达 。此外，一旦疫苗中含有的质粒接触到机体内的核酸酶，质粒就会被迅速降解，甚至得不到表达的机会。因此，通过针头注射器（NS）注射的DNA疫苗中，只有少量质粒被细胞吸收，而大部分滞留在细胞外，这种低下的吸收效率影响了抗原的产生，使应该被表达出来的抗原无法呈现给免疫系统，直接导致抗原表达不佳与免疫反应无效。为了应对这些挑战，大量的研究致力于开发能够提高DNA疫苗接种后的免疫反应的技术。对于疫苗本身，已经有修改疫苗中基因序列（密码子优化、启动子选择、基因佐剂、添加APC或T细胞靶向序列、去除细菌序列）、添加铝盐佐剂、添加化学递送物质（脂质或PLGA纳米颗粒、PEI阳离子聚合物）等方法，也有许多研究团队将目光落在了更基本的疫苗接种方法上，探寻电穿孔、粒子介导的表皮递送、NFIS、微针等物理接种方法的有效性。近期，一篇发表在vaccines杂志上的文献，就总结了时下众多有关DNA疫苗物理接种方法的研究

doi: 10.3390/vaccines11020280、

改善DNA疫苗效果的接种方法

1、粒子介导的表皮接种（PMED）

粒子介导的表皮接种技术又称为“基因枪 ”、“粒子轰击”，是使用特制的弹道装置，借助氮、氦等压缩气体动力产生的冷气体冲击波，将携带DNA的金粉微粒经由皮内或粘膜途径轰击细胞（图1）。研究表明，与其他递送方法相比，PMED方法诱导的免疫反应更主要基于Th2、因此诱导的细胞免疫水平较差。这种方法还因为每一粒金粉微粒只能携带少量的DNA，存在单次接种的疫苗剂量太少的关键缺陷，以至于必须在多个时间、对不同皮肤表面区域进行多次接种，才能获得合适的接种剂量。其他缺点包括药物产品难以储存、金粉携带DNA性质不稳定、接种过程和效果不可控等问题，故而PMED传递现在不再用于人群DNA疫苗接种。不过这项技术正在部分临床前研究中重新进行评估，也许会有新的发现。

2、电穿孔 （EP）

电穿孔技术主要用于在接种DNA疫苗后增加质粒在细胞内的传递，以增强免疫反应（图1）。

电穿孔技术的使用方法是：在用NS注射DNA疫苗后，通过一个或多个插在疫苗接种部位附近的针头施加电流，产生电脉冲，使接种部位的细胞打开临时通道，从而增加细胞膜的渗透性，使质粒高效进入细胞质并转入细胞核。这种方法可以使DNA疫苗的质粒转染率提高100-2000倍。产生的电脉冲还会引起局部细胞死亡和组织损伤，引起机体产生损伤相关分子模式的释放，算得上是一种“物理佐剂”；EP还能引起局部产生炎症细胞因子以及局部APC和T细胞的迁移。通过这种方式，可以将免疫反应增加10-1000倍。

EP更常见的不良事件是注射部位的疼痛和出血，其他缺点包括需要接入电源、设备昂贵笨重、肥胖患者使用困难、需要评估出具个体化电穿孔方案，以及引起组织损伤后可能产生的有害影响。更近，EP也已加入临床试验，以促进COVID-19、HPV、MERS和各种癌症的DNA疫苗研究。

3、无针注射系统 （NFIS）

NFIS的开发可以追溯到20世纪30年代，人们用这种方法防治天花、小儿麻痹症和麻等传染病的流行。NFIS器材开口狭窄，通过高压产生的高速喷射流，可以在零点几秒内穿过开口并有效刺穿皮肤，将注射液送入体内、IM或SC组织（图1）。NFIS的主要包括以气体或弹簧为动力的设备，不需要接入电源，也不需要使用针头，可以为每个接种者快速提供一次注射或连续多次注射。早期受生产力水平限制，多使用重复注射器，常造成交叉污染，到20世纪90年代，NFIS设备基本上全部更新为一次性注射器，解决了这一问题。

节省疫苗的接种剂量代表的是疫苗的“应急能力”，这样的效果可以使人们快速应对紧急公共卫生需求和危急情况，而不需要再焦头烂额地想办法提高疫苗制造能力和制造规模。与NS相比，NFIS能够以更快的注射时间提供稳定而准确的注射量，大大减少了疫苗的浪费。

NFIS的好处不止于此。顾名思义，无针注射系统更重要的优势就是减少了针头的使用量，降低了医疗废品处理成本，照顾了全球发病率高达32%的针头恐惧症患者的感受，以及消除了针头重复使用和针刺伤的风险。要知道，全世界56%以上的医护人员在职业生涯中都会出现被医疗针头刺伤的情况，面临着严峻的职业暴露危机，不得不说，这个优点对于一线疾控人员极为友好。

当然，没有接种方法是十全十美的。NFIS的缺点包括：在不经常使用NFIS的地区，医护人员对其缺乏了解；较NS相比，NFIS的成本更依赖具体生产能力、卫生应用领域、需求量及生产规模，高收入与中低收入国家之间存在的差距造成普及推广NFIS有一定困难；由于人群和疫苗种类特性不同，注射渗透率存在差异；需要预先设定注射量；不适用于静脉注射，也不能以预填充的形式提供；可能会增加注射部位的疼痛和基于注射物类型的不良反应；由于包括疫苗剂量、给药途径、动物模型选择等各种复杂因素，与其他物理给药方法相比可能会降低免疫原性或临床疗效。

图1、用于DNA疫苗的物理传递方法概述

（A）四种类型的物理递送方法的描述。

（B）在注射过程中， DNA疫苗被插入皮内、皮下或肌肉组织，

（C）然后DNA被运送到细胞中，

（D）并进入细胞核，

（E）在那里DNA被转录成mRNA，

（F）然后在细胞质中被翻译成抗原肽，经过处理后

（G）在细胞表面呈现给各种免疫细胞，以诱发体液和细胞免疫反应。NFIS=无针注射系统；N/S=针头和注射器；EP=电穿孔；PMED=颗粒介导的表皮传递。

NFIS与EP、PMED的比较

截至目前，在提高DNA疫苗的免疫原性和疗效的研究中，EP是研究数量更多的物理传递方法。与EP相比，NFIS具有不需要外部电源、使用简单便捷等优点，也消除了接种者感知到与插入针头和电脉冲有关的不良刺激等。

在将NFIS与这些先前建立的方法进行比较时，更初的临床前实验通常会测量接种前和接种后的免疫原性和临床反应，并评估便捷性和患者耐受性，更后再推进到临床试验。对于PMED，它的研究热度已经趋于消散，也不再被常规使用，因此对这一方法不再赘述。对于EP，现在已有许多研究报告称，NFIS方法接种疫苗后的免疫原性反应往往不逊于EP，并且更容易使用，也更容易耐受。相关的临床前研究见表1、

表1、比较质粒DNA疫苗输送与NFIS、EP或PMED的研究

NFIS的应用

1、传染病流行期间使用NFIS接种DNA疫苗

表2、用NFIS接种的流行病毒质粒

2、NFIS为新出现的传染病提供DNA疫苗接种

已有研究团队为多种新出现和重新出现的传染病或有可能作为生物武器使用的病毒制剂开发了基于DNA的疫苗。与前述结果类似的是，在临床前和临床试验环境中，与传统的NS接种相比，NFIS接种提高了接种后的免疫原性。相关的研究见表3、

表3、用NFIS接种的新发传染病质粒DNA疫苗

NFIS的现状和前景

通过NFIS递送的预防性DNA疫苗往往能诱导出不逊于电穿孔的免疫原性，而且与NS方法相比，更能增强免疫反应。无针注射系统（NFIS）可以诱导有效的免疫原性，增强保护效力，颠覆了传统NS接种的方式，是一个有吸引力的替代方案，2021年紧急批准使用完全通过无针注射系统提供的针对COVID-19的DNA疫苗后，疫苗接种技术和DNA疫苗的普及都取得了里程碑式的发展。

与传统的NS接种方法相比，新一代NFIS具有几个重要的优点。提高疫苗接种后的免疫原性是所有疫苗研发者共同的目标，而NFIS能更有效地将DNA送入细胞以产生所需的抗原，通常产生超过NS且与EP相当的免疫原性，毕竟NS有时也不能诱发有效的免疫原性。这种增加的免疫原性有望转化为更强的保护效力。

在比较EP和NFIS时，也可以看到NFIS有更多的优势，包括减少医疗废品处理成本，易于使用，以及更舒适的病人体验等。使用NFIS还可以有效地诱导体液和细胞免疫，COVID-19疫苗的Th1偏向反应研究显示，NFIS还可以产生独特类型的免疫反应。临床前动物模型也表明，在免疫抑制和怀孕期间等特殊临床状态下，用NFIS接种疫苗可以和其他接种方法一样有效。

NFIS具有节省剂量的作用，可以减少诱导有效免疫反应所需的质粒剂量，这在需要大规模快速生产DNA疫苗的某些传染病大流行中可能至关重要。腹腔皮肤有丰富的免疫细胞群，在该区域注射更能产生这种效果。事实上，NFIS已被用于针对其他病毒感染的大规模疫苗接种措施，并被证明比NS接种更具成本效益。

现在已有可以与NFIS相结合的其他技术，提高疫苗的免疫原性和保护作用。与传统的质粒DNA疫苗相比，合成的线性doggybone DNA消除了质粒DNA中的细菌基因，安全性又说提高，可以在GMP级别下更快速地生产。NFIS传递dbDNA疫苗并诱导出有效的免疫原性和保护作用的能力，使这项技术成为设计疫苗接种方案的一个有吸引力的选，比如，NFIS传递LNP配制的DNA疫苗能够以更快的速度和更少的DNA产生安全和更有力的免疫反应。另外，与佐剂（如CpG ODN）共同给药的DNA疫苗在NFIS中也是可行的，同样能提高免疫反应。

不过，NFIS并不总是成功的，根据DNA疫苗研发技术的不同，NFIS可能带有一定的局限性。与其他接种方法相比，导致免疫原性或临床疗效不佳的原因可能很复杂，包括所选择的动物模型物种、DNA构建体的序列和密码子优化、分子或传统佐剂的使用、注射途径（ID、IM、SC）、疫苗剂量、接种时间表、异源增效的使用、是否使用了LNP等免疫增效制剂，以及其他因素之间的相互作用。

总而言之，NFIS使用起来简单安全，通过临床开发项目和大规模免疫活动证明了其耐受性，同时提供了提高传统和现代疫苗平台性能的潜力。因此，在设计DNA和其他基于核酸的疫苗项目时，应考虑使用这种技术。

参考文献 [1]Wolff, J。A。; Malone, R。W。; Williams, P。; Chong, W。; Acsadi, G。; Jani, A。; Felgner, P。L。 Direct gene transfer into mouse muscle in vivo。 Science 1990, 247, 1465–1468、 [2]Ledesma-Feliciano C, Chapman R, Hooper JW, Elma K, Zehrung D, Brennan MB, Spiegel EK。 Improved DNA Vaccine Delivery with Needle-Free Injection Systems。 Vaccines (Basel)。 2023 Jan 28;11(2):280、 doi: 10.3390/vaccines11020280、 PMID: 36851159; PMCID: PMC9964240、

撰写| Vaccine前沿

校稿 | Gddra 编审| Hide / Blue sea

编辑 设计| Alice

二、dna多长时间鉴定不出来

三、dna要多长时间出结果

病原学诊断是感染性疾病诊断中更重要的一环，对于提升中重症感染性疾病的诊疗质量至关重要，其中分子诊断是病原学诊断中的一个重要方向。随着现代分子生物学技术的发展，出现了很多分子诊断方法，如DNA限制性内切酶分析技术、核酸探针杂交技术、聚合酶链反应（PCR）技术和环介导等温扩增（LAMP）技术等[1-4]。这些技术的发展促进了临床病原体检测的精细化，在常见感染的诊断方面发挥了巨大作用。病原体高达上万种，但常规的临床病原学诊断往往只能针对几种目标病原体进行检测，且目标病原体的检测依赖于临床的判断。因此，由于病原体的多样性，传统检测手段的局限性，以及临床对目标病原体的判断水平参差不齐，在临床上超过2/3的感染性疾病更终仍无法鉴定其病原体，导致临床不能针对性地用药，经验试错情况时有发生。这一困境在临床重症感染性疾病，特别是由疑难、罕见的病原体导致的临床重症型病例上尤其严峻。

随着基因组学技术的发展，高通量测序技术〔又称下一代测序技术（NGS）〕越来越广泛地应用于感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等各个方面，并且朝着快捷、经济的方向飞速发展[5]。2008年和2011年，Palacios等[6]与Xu等[7]分别采用宏基因组及宏转录组发现了两个临床感染病例的新发病原体，分别为沙粒病毒和新型布尼亚病毒，开启了宏基因组学测序（mNGS）技术在临床感染中应用的先例。由于mNGS不依赖于特定基因引物的序列扩增，而是将待测样本的所有DNA或RNA混合测序，并通过将测序数据与病原体数据库进行比对，获得病原体的分类信息，因此能在较短的时间内完成对样本的无靶向检测，单次即可检测上千种病原体，检测的病原体种类包含病毒、细菌、真菌和寄生虫等[8-9]。

就现阶段而言，受限于高昂成本，mNGS主要集中应用于重大疾病、突发公共卫生事件和特定病例人群，目前尚未纳入常规临床检测[10]。此外，由于临床测序检测设备还未实现小型化、设备实验条件的标准过高、临床感染工作者对mNGS的认知和接受程度不足，以及检测结果的科学判读证据与逻辑尚待证实等原因[11-14]，mNGS临床应用开展仍不广泛。可以预见，随着测序技术的进步、测序成本的降低以及生物信息手段的提升，mNGS在临床的应用会逐渐广泛开展起来[11]。因此，为了进一步促进和规范mNGS的合理应用，兼顾社会经济负担，促进病原体的诊断、正确判读检测结果和意义，我们组织重症、感染病学（含传染病学）和病原微生物学相关领域的专家共同研讨并制定了本共识。由于本共识是总体指导意见，不进行具体证据分级。

1检测与质控

1.1检测设施设备控制：

必须按照医疗机构临床基因扩增检验实验管理办法的相关规定开展临床mNGS。检测实验应符合医疗机构临床基因扩增检验实验工作导则的相关规定。实验空气洁净度需要建立标准对照和监测系统，实验存在的背景微生物需要进行定期的汇总更新。测序设备需要采用获得国家医疗器械注册许可的测序平台。

1.2检测实验质控：

mNGS过程主要包括样本处理（包含运输）、核酸提取、文库构建、上机测序及数据比对与判读。对于这些影响检验结果的关键过程，需要有相应的质控点，包括运输过程保持低温状态、核酸提取质量、文库出库浓度和片段分布大小、下机总数据量、有效数据量、测序质量及数据分析可靠性等，任何不符合质控标准的检测都应及时终止并重新检测，或者在无法重新检测的情况下，可提供预警，以供临床参考。全流程的质控标准应包含但不限于如下几点：①每批次实验中都应该包括内参和（或）阳性、阴性对照品。②内参和（或）阳性对照品被有效检出且检测到的碱基序列片段数量应该满足实验预期的检测敏感度阈值。③对于不同类型的样本，建议有基本的序列数据量。因为mNGS的科学原理是对临床样本中的所有核酸进行高通量测序，除了测试到样本中包含的病原体序列信息外，一定也包含了人基因组或转录组的序列。由于临床样本中微生物的核酸含量远低于人核酸含量，通常不足人核酸含量的5%。因此，为了得到临床可信的检测结果，理论上需要将所有核酸都测试一遍，这就对测序的数据量提出了基本的要求。由于不同类型的临床样本中人宿主核酸的含量是不同的，因此对不同类型样本的测试数据量的要求也不同。在主要代表类型样本中，单位体积的人核酸含量排序为脑脊液＜支气管肺泡灌洗液＜血浆＜痰液＜胸腹水，本共识推荐的高通量测序序列数依次为2000万条（20million，20M）、0万条（40million，40M）、5000万条（50million，50M）、8000万条（80million，80M）、1亿条（100million，100M）。对于痰液和胸腹水样本，不仅是数据量需要增加，还需要进行适当的人核酸去除来确保检测的敏感度。④为确保序列比对的准确性，避免因同源错配导致的序列比对错误，建议测序序列读长不少于50bp（单端读长50个碱基）。推荐采用临床应用级别的数据库，对临床病原体的不同种、不同型别有满足需求的区分度。生物信息分析流程应该有统一标准，自动化为主，人工纠错为辅。建议mNGS结果报告应涵盖该批次实验中的内参、阴性和阳性对照品结果，并记录相关质控标准，如测序质量、单个样本数据量、序列读长、检出的病原体序列数及相对丰度等。

1.3测序结果的实验判读控制：

目前不同厂家测试产品的病原体检测判读阈值可能不同，因此下列标准应适用于所有二代测序病原体检测流程。满足质控标准的合格的下机数据进入分析解读流程后，应遵循以下原则：①剔除试剂、环境中引入的假阳性病原体信息；②剔除比对流程中交叉引入的假阳性病原体信息；③报告病原体信息原则上准确到种（检出序列数极少、相似度极高的病原复合群和分节段分型的病毒等例外），同时也应包含相应的属信息；④建议将临床高度关注和健康者样本中极少出现的病原体信息优先呈现（即高度致病可能性），同时将某些部位（如呼吸道、皮肤、肠道等）的常见、低（或无）致病性病原体（定植菌等）独立呈现。

1.4数据库建设：

用于生物信息分析的数据库构建包括两个内容，即人源数据库和病原体数据库。人源数据库收集需尽可能完整，不仅包含染色体基因组，还要包括线粒体等基因组、转录组及非编码序列信息。病原体数据库收录的信息应该覆盖主要的病原体，且确保每条收录的序列数据准确完整。

2规则及应用

2.1不同病原体检测方法的特点：

临床样本中病原体的常规检测范围包括鉴定培养物中生长的微生物，通过血清学实验检测特定微生物的生物标志物〔如通过乳胶凝集进行抗原检测或通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行抗体检测〕，或通过分子生物学实验进行单个或多重病原体特异核酸检测。这些方法虽然多，并且可以组合应用，对于常见高发感染也非常有效，但是它们都属于试错型，高度依赖于临床的判断选择。目前在重症感染病例的诊断上，试错型尝试病原体检测耗时较长，临床总体阳性率也比较低。临床mNGS的技术特点是能够大范围甚至是全方位试错，为临床提供了一个快速的检测手段。但目前由于新技术的成本较高，且mNGS与宏转录组学测序（mtNGS）存在差异，导致临床敏感度与预期相对较低，简单地增加成本投入能有效提高临床敏感度。此外，临床mNGS除了测序生化反应外，还包含了病原体数据库自动分析比对专家系统，对于检测结果的准确性也非常重要，故不是一个简单的测序反应。一线，尤其是从事重症病例治疗的，需要对mNGS的临床应用有更多的了解，才能使mNGS更好地服务于临床。

2.2 mNGS报告解读规则：

mNGS报告通过测序短序列的数量进行物种的鉴定，碱基序列片段数量越大，表明该物种在样本中存在的可能性越高，但需要区分不同物种。同时需要考虑基因组的覆盖度，覆盖度与可信度呈正相关，但并非呈线性正相关。

2.3阴性结果的解读：

mNGS报告中的信息是经过特定阈值过滤后的结果，如果是阴性报告，首先需要分析患者的具体情况，再研究除报告外的原始检测结果，判断是因为未达到阈值误判，还是确实不存在病原体。可以根据具体的临床信息，在报告阈值之外考虑可能的原始检出感染病原体，如胞内感染菌。在阴性结果中，如果没有进行RNA的宏基因组检测（也称为mtNGS），可能遗漏了以RNA为遗传物质的病毒，需进一步检测宏转录组以明确病原体，如一种新型病毒性脑炎RNA病毒的发现[15]，否则存在假阴性的可能。对于某个临床样本，mNGS和mtNGS都为阴性的情况下，且内参检测值提示该样本中单位体积内（通常为1mL）已知更小病毒小于10个分子时，可以考虑阴性价值，即患者不存在感染性疾病，可能存在免疫性疾病和肿瘤等[16]。

2.4阳性结果的解读：

因不同部位临床样本的背景微生物存在差异，故阳性的判读需要建立阈值才可以将真阳性的病原体从背景微生物中分离出来。这些阈值可以包含一些指标，如检出特定微生物序列的数量、归一化为每百万序列的相对值、检出微生物的基因组覆盖度及内参对照的检出等情况。但需要在相同的测序平台、相同的实验进行比较，以排除平台和环境差异带来的影响。而当某个鉴定达到阳性判断阈值后，其增量与可靠性呈正相关，但并不呈线性相关，在未达到阈值时，其增量与鉴定可靠性呈指数正相关。因此，在判断阳性时，达到阈值即可信。此外，在阳性报告中，如果有多种微生物大量存在，则应结合定植微生物考虑假阳性物种。而针对一些常见病原体，需考虑并增加耐药基因的检测，以提供更多的临床治疗指导方案。

2.5常见微生物检测结果与临床检测结果不一致，且不能排除感染时，应作为怀疑的依据，再次送高通量检测；如果高通量检测的对应病原体序列升高，则提示有非常见的微生物，与临床信息吻合，应选择靶向抗感染治疗。

2.6非体内正常定植菌的外来侵入性微生物在非感染部位出现，一旦被检出，即认为是病原体。

2.7对于区别背景微生物、病毒以及快速分裂期的微生物，mRNA的诊断价值有待进一步临床观察与研究加以证实。如果相应mRNA序列数增加，则提示可能存在DNA病毒快速繁殖，要与病毒RNA进行鉴别[17]。

2.8延迟阳性：

有一些病原体由于被吞噬细胞吞噬，经一段时间裂解释放核酸后才能被检出，需考虑多次送检。

2.9物种差异判读：

不同的病原体类型对应的阈值不同，应分类解读。

2.9.1病毒：

一些显著区别于人基因组序列的病毒，如腺病毒和流感病毒等，有少量的特异序列检出即可信，其阈值通常在3/100万及以上即为可信；而一些与人源序列相似度高的病毒，如反转录病毒类，在检出序列较少时，因无法判断是否来自一些转录元件，只有更多序列检出时才可信，其阈值通常需要超过1000/100万，因为哪怕确实是某类反转录病毒，相对较少的检出序列也更多指向其在人体内是潜伏状态，而不是感染状态。

2.9.2真菌：

真菌的基因组较大，并且存在较厚的细胞壁，因此在核酸提取的效率上会大打折扣，即使进行了一些破壁处理，其检出的特异序列数仍然不会很多，因此对于真菌的鉴定，其阈值考虑在5/100万以上，在达到100/100万以前，其可信度随序列数增加而增加。

2.9.3细菌：

对于一些细菌来说，要着重区分是定植菌、污染还是真正的病原菌。对于非胞内感染菌，因不同细菌间存在同源相似性，菌种间可信阈值差异较大，并且因不同实验而有差异，因此鉴定报告应给出具体菌种的阳性参考阈值，并列出背景菌作为参考；而对于胞内感染菌，如结核分枝杆菌[18]和军团菌的阈值相对较低，通常有1/100万即可考虑可信，随着序列数增加，其可信度逐渐增加，但达到30/100万时，其增量不再有增加可信度的意义。

2.9.4寄生虫：

因为目前寄生虫的基因组参考数据库种类不多，且寄生虫生物的多样性，作为真核生物，有很多与人基因组相似的元件，因此在判断阳性时要特别要求序列的特异性。寄生虫作为阳性判断的阈值需在10/100万以上，并且需要严格确认序列的特异性。

2.10罕见病原体的阳性价值：

罕见病原体在报告中出现时，需要进一步确定其致病性及临床特征，包括感染病灶的影像。罕见病原体的确认需要进一步调查患者病史，以确定其为动物疫源[19]或者环境疫源[20]的流行病学证据。

2.11污染与定植：

在mNGS报告中，需要考虑取样和样本处理等环节带来污染的可能性。例如：呼吸道肺泡灌洗液的样本报告有大量的口腔菌，首先考虑取样是否存在污染，其次考虑由于特殊原因造成的感染。但是如果存在非常多的背景微生物或者杂菌，且没有1种或者几种病原体占有主导量的优势，可以间接考虑患者免疫状态严重破坏，需要引起治疗和护理上的重视。

3 mNGS技术展望

3.1耐药和突变的鉴定：

目前，mNGS得到的微生物序列在整个样本的总序列中占有极少的比例，通常不到5%，但鉴定的种类却很多。因此，每种微生物的鉴定虽然有结果，但是基因组的覆盖度却很低，一般不到1%。在这样的覆盖度下难以鉴定基因水平的信息，如耐药基因（ARGs）的鉴定和基因突变的鉴定。在纯科研领域采用高深度的测序结合宿主背景微生物的扣除已经实现，但临床应用成本太高，不适合普及。因此，一种更有效、廉价的mNGS鉴定加耐药鉴定将解决更多的临床需求，目前有公司推出的升级产品在mNGS基础上叠加耐药基因检测，可能是目前比较经济的过渡方法。

3.2 mtNGS：

随着技术的进一步发展，可以完成样本宏转录组的检测[21]。mtNGS技术是mNGS的进一步升级，是对样本中所有转录组的高通量定量检测。mtNGS技术对中枢神经系统感染中病原体的鉴定能扩展到以RNA为遗传物质的病原体物种，如对肠病毒等RNA病毒的鉴定，这是mNGS无法达到的。另外，mtNGS技术是对检测样本所有转录组进行检测，因此能够对样本中涉及到的人体免疫细胞进行全部近2万个基因的鉴定和定量，进一步可以分析细胞基因表达差异和代谢通，体现细胞的免疫状态，展示病原体与宿主的相互作用，对疾病的诊断更加个体化和精准化。当然，该方法对技术和受检样本质量的要求也更高，对技术环节的要求也更加严格。所以目前mtNGS的临床应用还落后于mNGS的应用。

3.3检验设备标准缺失，多种因素对结果解读的影响：

mNGS的局限性在于该方法的敏感度与人源背景微生物水平有关。例如：组织相对于无细胞体液增加了人类宿主比例，微生物序列的数量和比例相应减少，导致检测敏感度降低[10]。因此，提升数据量，即加深测序深度是解决该问题的很好办法，但这必将增加测试成本。同时，mNGS的整个运行流程还不够简化，操作较为复杂，相比单个或者多重的PCR检测来说操作步骤更加复杂，对于检测人员技术要求较高，测序仪器的差异对结果解读也会带来影响，而目前还没有对于测序仪器应用的标准，不利于在临床一线开展，因此，自动化平台成为了临床需求。自动化包括：①样本处理；②文库构建；③高通量测序；④生物信息分析；⑤报告发送。有研究机构已经完成了②到⑤步骤，步样本处理也已经完成了相对简单的血液、脑脊液等处理的自动化，但是感染性样本类型繁杂，目前仅实现了血液等简单样本处理的自动化，还远不能满足临床需求。因此，更完善的自动化本地实验检测将是更大的需求。完整的、有标准的一体机的使用将进一步推进mNGS在临床的应用。

3.4 mNGS时长的优化：

mNGS的临床应用已初步显示出其广谱鉴定病原体的有益效果，但目前很多方式都是在第三方实验集中检测，需要将样本寄送到指定实验，物流将花费整个检测周期1/2甚至2/3的时间。因此，在有需求的医疗机构开展mNGS病原体检测，是直接有利于患者的简单有效手段，这将给患者，尤其是重症患者争取1/2以上的检测时间，在更短的时间内得到病原体检测结果[10,22-23]。

3.5临床数据和微生物基线：

mNGS的高敏感度能够得到全谱微生物，包括病原微生物和定植微生物。但是不同人群，如不同年龄、不同基础疾病（炎症性肠病和糖尿病等）人群，有着不同的背景微生物。虽然人体微生物组计划已经进行了超过10年[24-25]，但对于目前临床应用来说，并没有按照特定人群进行阈值调整，而是采用统一的检测序列数标准[26]或者拼接序列数标准[27]。因此，不同人群的差异解读、病例基线和临床表型的具体生物标志物及个体免疫的综合作用，在未来应被纳入更多的重症感染疾病诊断和治疗当中，以便建立个人微生态档案，指导个体化鉴定和用药，为个体感染性疾病及时提供病原体信息和诊断依据。快速精准的床旁检测为早期靶向治疗、控制感染性疾病的传播、节约感染性疾病治疗费用和开拓广阔的应用前景创造了广泛的社会效益与经济效益。

3.6目前利用mNGS进行病原体鉴定还存在临床应用的一些问题，这些问题应该在短期内解决。

3.6.1产品本身的标准化和规范化：

当前mNGS主要于第三方实验开展检测，各机构提供的产品性能尚无有效的监管手段，商业利益驱动下部分检测机构将数据量降低到1M～5M，造成了大量的临床假阴性。国家相关监管部门已经着手建立技术标准，对相关检测产品进行规范化监管势在必行。

3.6.2数据库的完整性和准确性：

目前不同的检测机构都提供了自己的病原体数据库，其完整性和准确性缺乏统一的标准，因此，相关部门应联合主流检测机构，进一步确定数据库的质量标准，用于规范和提升mNGS的应用。一些已经发表的公共数据库可以直接用于样本的鉴定分析[28-29]，但缺乏与临床相结合，其软硬件资源需求设定巨大，仅可用于科研。

3.6.3算法的准确性和快速化：

mNGS报告通常含有多种病原体信息，其中不乏背景微生物。虽然这些微生物确实存在于样本中，但是与疾病的关系并不能明确，这也加大了报告解读的困难。更加准确的病原体鉴定算法和更快的鉴定速度应该是接下来努力的方向，快速、准确地鉴定定植菌和病原体将给临床应用带来革命性的突破。

4结语

目前mNGS只是病原体诊断新利器，是在其他临床病原体检测没有结果的情况下才选择的二线方法，尽管基于mNGS的病原体鉴定给临床实验检测带来了新的技术和平台，尤其针对重症感染患者，无需经验尝试的检测过程给患者赢得了治疗时间。但目前mNGS的病原体单次检测费用仍然较高，且基于成本、报销、时间及法规方面的考虑仍然是常规临床实施的主要障碍[30]。对于重症患者，尤其是重症监护病房（ICU）患者，快速全谱的病原体鉴定可争取靶向治疗时间，减少其他尝试性药物的使用，综合治疗费用可能更低。

目前，由于综合考虑了时间与费用问题，每个临床样本的处理和mNGS病原体检测的测序深度仅停留在相对较低的水平，因此其敏感度和功能也相对受限。一些非临床的科学研究采取了极高深度的测序和优化方法分析[31-33]，这种不计成本的方法使得一些新的病原体被发现。而这些方法在将来随着高通量测序费用的下降以及算法的优化，在临床应用上也会实现，包括但不限于直接在临床样本检测到耐药信息、新变异物种、定植和感染的区分等，为临床解决更多的实际问题。

总体来说，在众多的分子诊断技术中，mNGS作为一种全面的直接检测方法，虽然目前的经济成本使mNGS不太可能在短期内成为临床一线检测手段，但在疑难杂症、危重症、免疫缺陷等特殊人群中仍具有成为病原体诊断准一线检测手段的潜力，是一种非常有效的广谱病原体筛查方法。此外，mNGS与传统的分子、血清学检测等方法在感染诊断的检测中联合使用可发挥关键作用[21]。

牵头人：冯永文、陈唯军、姚咏明

顾问：陈德昌、杜斌、邱海波、管向东、黎毅敏

共识专家组成员（按姓氏笔划排序）：于湘友、马涛、马中富、马四清、马晓春、王小智、王华东、王凌伟、王瑞兰、王福祥、毛恩强、方向明、邓颖、邓启文、卢中秋、付小云、冯永文、吕奔、朱曦、刘勇、刘文兰、刘志锋、刘克玄、刘良明、刘治泱、刘映霞、刘雪燕、许硕贵、孙运波、孙炳伟、纪玲、苏磊、杜斌、李颖、李文雄、李金秀、李金宝、李春盛、李银平、李维勤、杨明施、肖献忠、吴明、吴伟立、吴健锋、邱海波、汪健、宋志、张卫星、张西京、张庆红、张庆富、陈旭林、陈唯军、陈德昌、武宇辉、林兆奋、林洪远、罗亮、周敏、周立新、周发春、郇京宁、郑江、孟新科、胡大海、祝筱梅、姚咏明、秦建军、桂水清、桂培根、钱克俭、徐平、徐道妙、黄磊、麻锦敏、康焰、梁华平、彭志勇、覃铁和、程锦泉、舒强、童亚林、曾红科、管向东、熊宾、熊丽红、黎毅敏

秘书：郑伟、任佳丽、任迪

利益冲突所有作者均不存在利益冲突

参考文献（略）

(责任编辑：admin)

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三、dna多久失效

回答(1)

胡建华副

浙江医学院 消化内科

通常情况下DNA要半天的时间才能检测出来。因为它要经过35个扩增循环，一般来说，至少要半天的时间，如果去大进行检查，当天出结果的可能性是比较小的，一般都是第二天才能出结果。一定要根据检测的报告阳性与否现在都要求做超灵敏度的乙肝病毒检测。如果患者做的是乙肝的检测是通过pcr的方法进行检测的，通常是代表乙肝病毒复制的一个指标。

四、dna要多长时间出结果

DNA检测是指通过基因测序技术对人类遗传物质进行分析的过程。 DNA检测的时间取决于具体的技术和实验步骤。

传统的DNA提取方法通常需要数小时至一天左右的时间来完成。这个过程包括将细胞或组织中的DNA提取出来，并将其纯化以便于后续的PCR扩增和测序操作。现代的高通量测序技术则可以实现快速、大规模的DNA序列测定。例如，Next-generation sequencing (NGS) 技术可以在几小时内生成数千到数十亿条短片段的DNA序列。这些数据随后被处理成可读的形式并用于进一步的研究和诊断。

总之，DNA检测所需的具体时间会根据所采用的方法和技术而异。一般来说，传统的方法可能需要较长时间，而现代的高通量技术则可以更快地提供结果。

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